What is Polymerase Chain Reaction (PCR) and its applications in medical diagnostics?

Apa itu PCR (Polymerase Chain Reaction)?

PCR adalah teknik biologi molekuler yang digunakan untuk mengamplifikasi (memperbanyak) segmen DNA spesifik secara cepat dan mudah, berdasarkan prinsip replikasi enzimatik asam nukleat. 1, 2

Prinsip Dasar PCR

PCR memungkinkan amplifikasi fragmen DNA dimulai dari jumlah sampel biologis yang sangat kecil menggunakan primer oligonukleotida yang berasal dari data sekuens. 3 Teknik ini dapat mendeteksi jumlah DNA atau RNA yang sangat sedikit yang terkandung dalam jaringan atau cairan, bahkan dari spesimen arsip yang telah diawetkan dengan berbagai cara. 4

Mekanisme kerja PCR melibatkan siklus berulang dari denaturasi DNA, penempelan primer, dan ekstensi enzimatik, menghasilkan jutaan salinan dari segmen DNA target dalam waktu singkat. 2

Aplikasi Klinis PCR dalam Diagnostik Medis

Deteksi Penyakit Infeksi

• PCR sangat sensitif untuk mendeteksi mikroorganisme patogen dengan akurat, termasuk virus, bakteri, dan parasit, bahkan dalam jumlah yang sangat rendah. 3, 5
• CDC merekomendasikan PCR untuk mendeteksi DNA Cyclospora cayetanensis dalam sampel tinja, dengan sensitivitas superior dibandingkan metode mikroskopi tradisional, mampu mendeteksi hanya 10-100 organisme. 6
• PCR dapat mendeteksi patogen bahkan ketika pelepasan organisme bersifat intermiten atau dalam jumlah rendah, yang merupakan keterbatasan utama mikroskopi. 6
• Untuk infeksi sistem saraf pusat, PCR meningkatkan kecepatan dan akurasi diagnosis, membantu mengidentifikasi penyebab infeksius untuk penyakit yang sebelumnya dianggap idiopatik. 4

Diagnosis Kanker dan Kelainan Genetik

• Dalam diagnosis Chronic Myeloid Leukemia (CML), RT-PCR kualitatif mengidentifikasi tipe transkrip BCR-ABL1, yang merupakan penanda molekuler kunci untuk diagnosis dan monitoring. 1, 7
• European LeukemiaNet menekankan bahwa laboratorium yang menggunakan metode berbasis RT-PCR sebagai skrining primer untuk BCR::ABL1 harus memastikan metodologi mendeteksi varian BCR::ABL1 tipikal dan atipikal untuk menghindari misdiagnosis hingga 2% kasus CML sejati. 1
• PCR memungkinkan deteksi klon sel dengan rearrangement atau translokasi gen dengan sensitivitas tinggi, berguna untuk monitoring efek terapi tumor, terutama pada pasien dengan limfoma dan leukemia. 8

Deteksi Fusi Gen dalam Sarkoma

• RT-PCR mendeteksi transkrip RNA fusi gen dan dapat bersifat kualitatif atau kuantitatif, dengan hasil tersedia dalam sekitar satu minggu. 1
• NCCN menyatakan bahwa analisis molekuler berbasis PCR lebih sensitif daripada sitogenetik konvensional dan merupakan tambahan yang berguna untuk diagnosis alveolar rhabdomyosarcoma, synovial sarcoma, dan myxoid liposarcoma yang memiliki variasi partner gen fusi. 1
• Keterbatasan penting RT-PCR dalam pengujian fusi NTRK adalah keharusan mengetahui partner fusi dan breakpoint ekson saat mendesain primer, karena lebih dari 80 partner fusi berbeda telah diidentifikasi dengan variabilitas signifikan dalam breakpoint. 1

Variasi Teknik PCR

RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

• RT-PCR menggunakan primer yang mengapit region breakpoint dalam transkrip yang dikodekan oleh gen yang berfusi, dengan primer 3' menempel pada gen NTRK dan primer 5' menempel pada gen partner fusi yang relevan. 1
• Teknik ini memerlukan sekitar 1 μg RNA (kira-kira 50.000 sel tumor) dan keandalan sangat bergantung pada kualitas sampel RNA. 1

Triplet-Repeat Primed PCR (TP-PCR)

• TP-PCR mengamplifikasi region CAG(n) menggunakan primer forward berlabel fluoresen yang terletak upstream dari region CAG(n), dan primer reverse kimerik yang terletak sebagian dalam region CAG(n). 1
• Primer reverse kimerik berhybridisasi ke beberapa lokasi dalam region repeat CAG(n), menciptakan produk PCR dengan berbagai ukuran yang memberikan pola tangga karakteristik pada trace fluoresen. 1
• ACMG merekomendasikan TP-PCR atau Southern blot untuk identifikasi ekspansi besar yang terkait dengan Huntington disease onset juvenil dalam kasus genotipe normal homozigot yang tampak. 1

Digital Droplet PCR (ddPCR)

• ddPCR adalah penyempurnaan bioteknologi dari metode PCR konvensional yang dapat digunakan untuk kuantifikasi langsung dan amplifikasi klonal DNA. 5
• ddPCR mempartisi sampel tertentu menjadi banyak droplet kecil di mana reaksi PCR individual terjadi, memberikan deteksi yang lebih sensitif, akurat, dan reproducible dari patogen dengan kelimpahan rendah. 5, 1
• ddPCR mungkin merupakan pilihan yang lebih baik daripada quantitative PCR untuk aplikasi klinis di masa depan, terutama untuk deteksi asam nukleat dengan kelimpahan rendah. 5

Pertimbangan Penting dalam Penggunaan PCR

Kontrol Kualitas dan Kontaminasi

• Karena tingkat amplifikasi PCR sangat besar, bahkan satu molekul DNA kontaminan dapat terdeteksi dan signifikansinya dapat disalahartikan. 8
• Kehati-hatian besar harus dilakukan untuk mencegah kontaminasi sampel, terutama oleh produk reaksi sebelumnya, dan setiap seri reaksi harus mencakup kontrol yang sesuai. 8
• Metode berbasis PCR memerlukan ekstraksi sampel yang hati-hati dari homogenat jaringan dan cairan tubuh untuk menghindari kontaminasi silang sampel. 1

Interpretasi Hasil

• Hasil PCR harus diinterpretasikan dalam konteks klinis, karena dapat terjadi carriage asimtomatik. 6
• PCR tidak dapat membedakan antara infeksi aktif dan infeksi yang baru sembuh, karena DNA dapat bertahan setelah kematian organisme. 6
• Pengujian molekuler harus dilakukan oleh ahli patologi dengan keahlian dalam penggunaan teknik diagnostik molekuler, dan hasil harus hanya diinterpretasikan dalam konteks fitur klinis dan patologis. 1

Keunggulan Dibanding Metode Lain

• PCR cepat dan mudah, membawa teknologi DNA ke laboratorium rutin. 3
• Dengan membuat diagnosis yang cepat dan tepat, pengobatan yang sesuai dapat dimulai, dan investigasi yang tidak perlu atau invasif dapat dihindari. 4
• PCR menghilangkan kebutuhan untuk teknik pewarnaan khusus atau proses sporulasi yang memakan waktu yang diperlukan untuk diagnosis mikroskopis. 6