Interpretacja wyników alogenicznej reakcji mieszanych limfocytów (MLR)
Podstawowe zasady interpretacji
W kontekście transplantacji nerek, ujemny wynik MLR wskazuje na tolerancję immunologiczną i brak alloreaktywności limfocytów T biorcy wobec komórek dawcy, co może pozwolić na transplantację bez immunosupresji. 1
Kiedy MLR jest szczególnie przydatny
Transplantacja po przeszczepieniu komórek macierzystych
- MLR należy wykonać przed transplantacją nerki u pacjentów, którzy wcześniej otrzymali przeszczep komórek macierzystych od tego samego dawcy, aby ocenić pełną tolerancję immunologiczną 1
- Brak reakcji limfocytów T w teście MLR wobec komórek dawcy potwierdza pełny chimeryzm i pozwala na transplantację bez leków immunosupresyjnych 1
- Taki wynik musi być potwierdzony dodatkowymi badaniami: ujemnym crossmatchem CDC i cytometrycznym oraz brakiem przeciwciał anty-HLA 1
Metodologia i interpretacja wyników
Podstawy testu
- MLR ocenia aktywację i ekspansję klonalną limfocytów T po stymulacji komórkami prezentującymi antygen (APC) od innego dawcy 2
- Test wykorzystuje komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów (moDCs) jako stymulatory, które indukują odpowiedzi alloreaktywne 2
- Reakcja wymaga prezentacji epitopów w kontekście MHC klasy I i II, więc supresja odpowiedzi odzwierciedla zdolność do zapobiegania alloreaktywności 3
Markery pozytywnej reakcji MLR
- Zwiększona proliferacja limfocytów T (mierzona inkorporacją 3H-tymidyny lub rozcieńczeniem CFSE) 3
- Ekspresja CD25 i Ki-67 na limfocytach T wskazuje na aktywację i proliferację 4
- Produkcja IFN-γ (wykrywana w ELISPOT lub barwieniu wewnątrzkomórkowym) 3
- Polifunkcjonalność limfocytów T i zwiększona ekspresja punktów kontrolnych immunologicznych 4
Różnice między odpowiedzią CD4+ i CD8+
- Limfocyty CD4+ i CD8+ różnią się kinetyką i amplitudą aktywacji w MLR 4
- Wzorce sekrecji cytokin i ekspresji punktów kontrolnych immunologicznych są odmienne dla każdej populacji 4
- Szczytowa odpowiedź występuje przy stosunku komórek docelowych do odpowiadających między 1:1 a 1:4 5
Interpretacja wyników w kontekście transplantacji
Wynik ujemny (brak reakcji)
- Brak proliferacji limfocytów T i produkcji IFN-γ wskazuje na tolerancję immunologiczną wobec dawcy 1
- Pozwala rozważyć transplantację bez immunosupresji u pacjentów po HSCT od tego samego dawcy 1
- Musi być potwierdzony ujemnym crossmatchem i brakiem przeciwciał anty-HLA 1
Wynik dodatni (obecność reakcji)
- Proliferacja limfocytów T i produkcja cytokin wskazują na alloreaktywność 2, 4
- Wymaga standardowej immunosupresji po transplantacji 1
- Zwiększone ryzyko ostrego odrzucania i utraty przeszczepu 3
Optymalizacja testu MLR
Poprawa wiarygodności wyników
- Użycie puli komórek docelowych od 3-4 różnych dawców zwiększa wielkość odpowiedzi i zmniejsza zmienność 5
- Stymulacja przez pulę komórek daje wyższą średnią i mniejszą wariancję niż pojedyncze komórki dawcy 5
- Usunięcie szybko proliferujących komórek szpiku przez wirowanie w gradiencie gęstości lub kriokonserwację eliminuje fałszywie dodatnie wyniki 6
Wybór stymulatorów
- Linie komórkowe B zdefiniowane pod względem HLA są bardziej wiarygodnym źródłem stymulatorów niż limfocyty krwi obwodowej 6
- Nie produkują rozpuszczalnych mediatorów zdolnych do stymulacji dodatkowych komórek, co eliminuje niespecyficzną aktywację 6
Pułapki i ostrzeżenia
Częste błędy interpretacyjne
- Nie należy polegać wyłącznie na MLR – zawsze należy wykonać crossmatch i oznaczenie przeciwciał anty-HLA 1
- Obecność szybko proliferujących komórek niebędących limfocytami T może prowadzić do fałszywie dodatnich wyników 6
- Rozpuszczalne mediatory z komórek stymulujących mogą aktywować komórki niebędące limfocytami T, maskując prawdziwy wynik 6
Ograniczenia testu
- MLR wymaga znacznego nakładu pracy i prawdopodobnie nie jest wykonalny do rutynowej oceny 3
- Test nie zastępuje funkcjonalnych testów supresji w ocenie komórek supresorowych pochodzenia mieloidalnego (MDSC) 3
- Zmienność odpowiedzi może być duża bez optymalizacji stosunku komórek i źródła stymulatorów 5
Zastosowanie w ocenie immunoterapii
- MLR jest szeroko stosowany do oceny związków immunoterapeutycznych i ich wpływu na odpowiedzi limfocytów T 4
- Cytometria przepływowa i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek pozwalają na głęboką charakterystykę aktywacji i funkcji limfocytów T 4
- Analiza sieci komunikacji komórka-komórka identyfikuje kluczowe komponenty synapsy immunologicznej między limfocytami T a moDCs 4